技术路线

10X Genomics利用微流体交叉系统，将含有标记序列barcode的凝胶珠、细胞及酶形成油包水的GEM结构，随后在该微体系中完成cDNA反转录，后续完成文库的构建及上机测序。

单细胞转录组测序样本类型：

制备好的单细胞悬液或血液、组织

单细胞转录组测序质量要求：

细胞活性大于80%，细胞浓度介于5*10^5—1.2*10^6/ml，细胞总数大于10^5个，细胞培养基及缓冲液不能含Ca2+和Mg2+，细胞体积需小于40μm，大于5μm。若采用单细胞核测序，建议台盼蓝染色，然后用细胞计数仪进行活性和浓度质检，满足：活性<10%，结团率<10%，背景干净，无碎片，60倍显微镜下观察核膜完整。

注：若客户组织样本消化困难，可与我们联系，派森诺的研发团队将竭尽所能提供帮助。

分析内容

分析结果展示

Cell Ranger 测序数据质量统计结果

UMAP分群结果

top10 marker基因UMAP映射图、

GO富集分析柱状图

GO富集分析气泡图

KEGG Pathway富集结果柱状图

KEGG富集分析

top3 差异基因在细胞群内的表达量分布对比图

经典案例

题目：Single cell transcriptome profiling of retinal ganglion cells identifies cellular subtypes

期刊：Nature Communications

年份：2018

影响因子：12.353

本文重新定义了视网膜神经节细胞类型并且鉴定了对应的marker基因。

取出生后5天的小鼠左眼和右眼的视网膜，解离成单细胞悬液后进行免疫抗体包被筛选，筛选得到视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）

通过聚类分析将6225个RGCs分成了40个亚群，这些RGCs均表达视网膜神经节细胞的marker基因Thy1与前期免疫抗体包被筛选结果一致，整体看这40个cluster的基因表达谱都比较相似，任意簇与簇之间的相关系数均大于0.9。下一步，作者鉴定了各亚群的marker基因，并通过免疫荧光原位杂交验证。

Q：细胞悬液的制备过程中是否会影响基因的表达？

A：目前常用的方法中，不管是酶消化还是机械操作都会不可避免的对细胞产生影响，前者会使细胞产生应激反应，后者则容易损伤细胞，进而影响细胞活性。所以，在单细胞测序实验设计时，设置对照是非常重要的。前述的这些影响，在case和control中同样存在，我们关注case和control的差异表达基因，就可以去除实验的系统误差，找到决定感兴趣生物学过程的关键基因。

Q：如何判断细胞类型？

A：细胞类型的判断是需要您自己选择Marker基因的，您可以参考同类物种或样本的已发表文章，或者根据数据库去确定Marker，比如CellMarker，panglao等。

Q：10XGenomics单细胞平台有什么优势？

A：一.细胞通量高，一次可捕获上万细胞 ；

      二.对细胞大小及类型限制低，且捕获效率达65% ；

      三.从悬液到文库构建周期短。