Q：1. 如何测定引物的OD值？

A： 用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。 

      举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。 

Q：2. 如何检测引物的纯度？

A： 实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶，12-60个碱基的引物用16%的胶，>60个碱基的引物用12%的胶，取0.2OD左右的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95oC,2min)。

      加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带)。

Q：3. 合成引物的稀释与保存?                                    

A： 初始拿到的DNA，其性状为薄膜状或者粉末状的白色粉末，附在离心管内壁上。稀释前，请将引物管离心数秒使DNA聚集到管低，小心开启管盖，以免引起粉末飞扬造成DNA损失，再加入适量的TE缓冲液，盖好管盖，漩涡振荡混匀并使其充分溶解。

      建议将引物稀释于TE（10mM Tris-HCL，pH8.0，1mM EDTA）溶液中，浓度高于10μM，并于-200C储存。 例如：如果您需要稀释到10μM，只需要加入（管内总nmol数/10）ml的TE即可。没有溶解的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反复多次冻融会降低使用寿命）。

Q：4. 荧光标记的DNA如何稀释与保存？                                    

A： 荧光标记（如HEX,TET,FAM,Cy3，Cy5等）的DNA对光较敏感，在合成及运输过程中。接到合成引物后，请立即避光保存。对于非Cy类的荧光标记引物，建议将引物稀释于TE溶液中，浓度高于10μM，并于-20℃储存于暗盒中。Cy3及Cy5标记的引物在碱性条件下易降解，所以此类引物应于中性条件下在-20℃避光保存。

Q：5. 一般的合成的引物在5"和3"末端有磷酸基团吗?

A：没有，5"和3"末端均为-OH基。如需要加磷酸基团，订货时请特别注明，此时需收取磷酸化的费用。

Q：6. 如何将两条互补的单链退火形成双链？

A： 用退火缓冲液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA)溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合，总体积不要超过500微升，加热到95℃ 2mins，然后缓慢冷却至室温(低于30度)即可。退火的产物可以放在4度待用。

Q：7. 引物在常温下运输，会降解吗？

A：不会降解，干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天，所以您收到的引物不会降解。

Q：8. 合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办?

A：PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑：

     1) 引物和模板是否配对，同源性有多大？ 

     2) 引物本身是否有立体结构？

     3) PCR反应用试剂是否能正常工作? 

     4) PCR仪是否工作正常? 

     5) PCR反应条件是否合适? 

     如果一切正常，还无法解决问题时，我们可以免费重新合成引物。

Q：9. 已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？                                    

A：如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料是模板的质量与先前使用的不完全一致。

Q：10. 引物纯化方式有哪些，如何选择？

A：◆ C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能去除盐分。

      它不能去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。

      对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。

     ◆ PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。

      PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化。 

     ◆ HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。

      纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。

Q：11. 如何计算引物的Tm值？

A：引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。 

      长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G C) 2℃(A T) 

      对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 81.5 16.6 x Log10[Na ] 0.41 (%GC) – 600/size 公式中，Size =引物长度。

Q：12. 引物（含修饰）的分子量是如何确定的？

A：非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x碱基的平均分子量。或按下列公式计算MW= (NA * WA) (NC * WC) (NG * WG) (NT * WT) (Nmod * Wmod)＋（Nx * Wx） ( Ni* Wi) 16* Ns– 62.NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod, 分别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G A混合的分子量为（313.21 329.21）/2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。 常规碱基分子量

Q：13.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？                                    

A：连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。