基于PacBio三代测序平台的全长转录组测序（Iso-Seq），可直接获得mRNA的全长序列，可更为准确地解读mRNA的结构信息。通过全长转录组测序，可克服无参考基因组物种转录本拼接短、信息不完整的难题，获取全长mRNA序列，实现同源异构体分析，单碱基变异检测， 可变剪接分析，同源基因识别及等位基因识别。
方案设计
全长转录组实验设计思路可以是单个样品进行测序，与参考基因组进行比较进行结构分析，亦可以对多个样品进行基因结构方面的差异比较分析。
技术路线
分析内容
分析内容展示
基于 Pacbio Iso-Seq 的转录本表征
差异基因染色体分布
融合基因圈图
Q：全长转录组为什么推荐“三+二”？
A：目前已报道全长转录组文章大都采用“三+二”的模式，三代建库测序以检测更准确的结构变异为主，对于有参考基因组物种可以准确检测可变剪切，融合基因，新基因的预测，对于无参考基因组物种提供准确的参考序列，有助于后期差异分析；二代测序转录组研究可以实现较三代更准确的定量。此外“三+二”模式可以利用二代的数据对三代进行校正。
Q：全长转录组是否需要打断，拼接？
A：全长转录组是基于PacBio Sequel三代测序平台，无需打断拼接，直接获得包含5’，3’UTR，poly A tail的完整转录本，从而准确分析有参考基因组物种可变剪切及融合基因等结构信息，克服无参考基因组物种转录本拼接较短、信息不完整的难题。
Q：如何选择全长转录组测序数据量？
A：基于PacBio Sequel平台，如果是想获得转录组中高表达基因，可选择1个文库测1-3个Cell （5~15G数据），如果想获得更多低丰度基因，建议1个文库测3个Cell以上。同时，也需要参考研究物种转录组复杂性，如多倍体物种，基因数量一般相对较多，在参考上述情况后，需适量增加数据量。
Q：什么物种适合全长转录组测序？
A：参考基因组和无参考基因组的物种均适合。
Q：全长转录组测序如何取样？
A：主要依据研究目的而定。通常，如果想获得某物种比较多的转录本信息，建议采集不同组织样本提取RNA，等量混合测序，得到尽可能多的表达转录本。如植物，建议取根、茎、叶、花、果实等；如动物，建议取肝脏、肾脏、肠、皮肤等部位；如果只针对某个组织部位进行组织特异性全长转录组分析，则可只对该组织取样，也可以取该组织不同的发育时期样品提取RNA，等量混合分析。
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